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L-半胱氨酸对葡萄交链孢霉腐病的抑制作用(一)

发布时间:2021-01-12 13:38 作者:陈丹
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葡萄是一种高营养水果,果实富含大量的糖、有机酸、维生素、各种矿物质以及人体所需的氨基酸等,集食疗、医用、美容和商业价值于一身,深受广大消费者的青睐。然而葡萄是不耐贮藏的水果之一,果实皮薄、汁多、肉软,采后极易受病原微生物侵染,造成巨大的经济损失。其中,交链孢霉腐病是最为突出的采后病害之一,其主要致病菌为链格孢菌(Alternaria alternata),其对生态环境的适应能力强,生长繁殖快,严重影响寄主的质膜透性、酶活性、激素平衡及其他生理代谢过程,从而造成果实大量腐烂。

目前,已有许多研究者将L-半胱氨酸应用于葡萄交链孢霉腐病的防治,例如那他霉素可以抑制葡萄采后交链孢菌引起的腐烂变质;二氧化硫可以抑制交链孢菌的孢子萌发、菌落生长及其所引起的葡萄腐烂率。臭氧处理可导致互隔交链孢菌菌丝的干瘪萎缩和孢子凹陷褶皱,导致其致病力减弱;芽孢杆菌发酵液产生的挥发性气体亦能明显抑制链格孢菌的生长,L-谷氨酸对番茄果实的交链孢霉腐病也有防治作用。但现阶段仍然需要寻找更安全、更有效、更经济、更便捷的新型杀菌剂替代品来控制由交链孢霉腐病引起的采后果实烂果现象。

L-半胱氨酸是组成体蛋白质的氨基酸中唯一一种含有巯基的亲水性氨基酸,也是一种还原剂,能够通过改变蛋白质分子之间和内部的二硫键减弱蛋白质的结构,使蛋白质伸展开,具有多种药理功效,包括抗氧化和抗炎作用,在生物化学、医药、食品、饲料、化妆品等行业中已得到广泛应用,国内外需求量也逐年增长。Kyung等研究表明S-甲基-L-半胱氨酸亚砜能够有效清除芸苔属蔬菜中的氧自由基,具有杀菌作用。Zhou Xiran等认为L-半胱氨酸是一种非竞争性的有效抑制剂,能够有效抑制黄果梨多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的活性,防止梨汁加工过程中的酶褐变反应。廖春丽等研究表明,L-半胱氨酸对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用明显,且随着L-半胱氨酸浓度增大,酶活力降低幅度越大。Hamza等研究表明L-半胱氨酸对氧化组织损伤具有保护作用,能够提高脂质的水平,增加酶的抗氧化活性,降低脂质过氧化程度。但关于L-半胱氨酸应用于葡萄交链孢霉腐病的研究还鲜有报道。本研究旨在探讨L-半胱氨酸处理对离体链格孢菌的抑制作用及抑菌机理,并在葡萄果实上接种验证,为L-半胱氨酸处理在葡萄贮藏保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

葡萄链格孢菌来源于华东师范大学生命科学学院,于PDA培养基中4 ℃冰箱保存。

“巨峰”葡萄购自上海市奉贤区嘉园路87号水果店,挑选色泽、大小一致,且无机械损伤、无病虫害的果实,购买当天装在水果泡沫箱中运回(4.0±0.5)℃的冷库中预冷并贮藏保存。

L-半胱氨酸、乙酸、无水乙酸钠、领苯二酚、过氧化氢、愈创木酚、吐温-80、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose ager,PDA)培养基、无水乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100 国药集团化学试剂有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪 美国安马西亚公司;HVE-50高压蒸汽灭菌锅 日本托米公司;CA-1480超净工作台 上海上净净化设备有限公司;D37520 Osterode高速冷冻离心机德国Biofuge公司;水浴锅 上海一恒科技有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海益恒实验仪器有限公司;打浆机 广东美的生活电器制造有限公司;SPX-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;血球计数板 上海求精生化仪器有限公司;倒置显微镜 日本奥林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子悬浮液的制备

将在冰箱保存的链格孢菌取出,于25 ℃ PDA培养基上培养7 d,用含0.05%吐温-80的无菌水冲洗平板洗下孢子,并用血球计数板调整至浓度为1.0×106 个/mL的孢子悬浮液备用。

1.3.2 实验处理

1.3.2.1 离体实验

将PDA经灭菌后冷却至45 ℃左右,加入量的L-半胱氨酸混匀,制成L-半胱氨酸质量浓度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L和3.0 g/L的PDA培养基,以不加入任何药剂的PDA培养基为对照组。每组处理设置3 个重复,平板凝固后,移液枪取20 μL菌悬液滴在PDA培养基中央,室温条件下放置4 h后放入25 ℃的生化培养箱中培养,每天测定一组数据,直至对照组菌落长满培养皿。

1.3.2.2 活体接种实验

选择外观整齐、无病虫害和机械损伤的葡萄果实,先用自来水将果面冲洗干净,然后用体积分数2%次氯酸钠溶液浸泡2 min,接着用体积分数75%乙醇溶液浸泡1 min,再用无菌水冲洗3 次,晾干后用无菌剪刀剪下葡萄果实(保留果梗)。无菌接种针在葡萄赤道部刺深约3 mm,滴入10 μL菌悬液,室温(25±1)℃条件下放置4 h后,以离体菌菌落生长的研究结果为依据,选取质量浓度分别为1.6、2.0、2.4、2.8 g/L的无菌L-半胱氨酸溶液用移液枪摄入10 μL至上述针刺部位,并于室温(25±1)℃条件下放置4 h,之后放置在25 ℃培养箱中贮藏。每3 d测定葡萄果实病斑直径和病斑率,直至病原菌布满果面,其他指标在贮藏结束时测定。每个处理组取50 粒葡萄,设置3 个重复。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 L-半胱氨酸对离体链格孢菌菌落生长的抑制作用

用十字交叉法统计每天链格孢菌的菌落直径,并计算第6天的菌落生长抑制率,具体计算见公式(1)。

1.3.3.2 链格孢菌菌丝形态的观察

分别在含不同质量浓度的L-半胱氨酸的PDA培养基上滴20 μL浓度为1.0×106 个/mL的链格孢菌菌悬液,以不加任何药剂为对照处理。室温下放置2 h待菌悬液晾干,然后放置在25 ℃的恒温培养箱中培养。24 h后用无菌刀在中央位置取2 cm×2 cm×2 cm的培养基小块,制成玻片在倒置显微镜下观察并拍照,每一个玻片取不同的7 个视野观察并拍照,每组设置3 个重复。

1.3.3.3 链格孢菌芽管伸长抑制率的测定

按1.3.3.2节相同方法取2 cm×2 cm×2 cm的培养基小块,在倒置显微镜下观察并用显微镜上的测量尺测量每一组芽管的长度并记录。芽管伸长抑制率计算见公式(2)。

                                            

1.3.3.4 链格孢菌孢子萌发抑制率的测定

将1.0×106 个/mL链格孢菌菌悬液接种到L-半胱氨酸的PDA培养基,25 ℃恒温培养箱培养6 d后,用直径为0.6 cm的打孔器在培养皿边缘取3 个菌碟,无菌水洗下孢子并用托马计数池进行计数,每组处理重复3 次,通过公式(3)计算孢子萌发抑制率。

                                            

1.3.3.5 葡萄果实发病率、质量损失率和落果率的测定

病斑直径采用十字交叉法测定,取平均值;病斑直径若大于0.5 mm则确定为发病,发病率计算见公式(4)。在贮藏前后称果实质量,并按公式(5)计算果实的质量损失率。统计果梗的腐烂程度,果梗发生霉变为腐烂,未发生霉变为正常,果梗腐烂率的计算见公式(6)。另外,果实在贮藏期会出现落果现象,即果梗和果实发生分离的现象,落果率计算见公式(7)。

                                               

1.3.3.6 抗性酶活力的测定

过氧化物酶(peroxidase,POD)活力测定采用愈创木酚法;PPO活力的测定采用邻苯二酚比色法;丙二醛含量、CAT活力、SOD活力采用试剂盒测定。

1.4 数据统计与处理

所有实验数据采用Microsoft Excel 2007软件计算标准偏差,并用Origin 8.0软件作图,用SPSS 17.0软件进行差异显著分析(方差分析),P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著,P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 L-半胱氨酸处理对链格孢菌菌落生长的影响

由表1可以看出,与对照组相比,各质量浓度L-半胱氨酸处理对链格孢菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,且在0~2.8 g/L范围内,随着L-半胱氨酸质量浓度的增加,对链格孢菌菌丝生长的抑制效果逐渐增强,其中2.8 g/L L-半胱氨酸处理组菌丝生长抑制率最大,L-半胱氨酸质量浓度超过2.8 g/L后,其对链格孢菌菌丝生长的抑制效果减弱。另外,对照组链格孢菌菌丝基本长满培养基表面,菌丝颜色较深,偏向暗褐色,且随着L-半胱氨酸质量浓度的增大,链格孢菌菌落直径减小,其中2.8 g/L L-半胱氨酸处理组的菌饼直径最小。培养第6天时,与其他各组比较,2.8 g/L L-半胱氨酸处理组菌落直径仅为0.25 cm,抑制率最高(95.96%)。由此表明L-半胱氨酸能够有效抑制链格孢菌菌丝生长,其中2.8 g/L L-半胱氨酸处理的效果最好。

表1 L-半胱氨酸对链格孢菌菌落生长的抑制作用

注:同列肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 L-半胱氨酸处理对链格孢菌孢子萌发及芽管伸长的抑制作用

将链格孢菌菌悬液滴入含有不同质量浓度L-半胱氨酸的PDA培养基中恒温培养24 h后,于倒置显微镜下观察,含0.4~1.0 g/L L-半胱氨酸的PDA培养基中可以清晰观察到链格孢菌孢子萌发且有芽管伸长现象,而L-半胱氨酸质量浓度大于1.0 g/L的PDA培养基中均未明显观测到孢子萌发及芽管伸长。由图1可知,L-半胱氨酸对链格孢菌的孢子萌发具有显著抑制作用,0.4、0.6、0.8 g/L和1.0 g/L L-半胱氨酸处理组的孢子萌发抑制率分别为6.73%、11.68%、21.64%和37.87%,1.0 g/L L-半胱氨酸处理组孢子萌发抑制率显著高于其他处理组(P<0.05),说明高质量浓度L-半胱氨酸对链格孢菌的孢子形成抑制率效果显著。由图2可知,与对照组相比,不同质量浓度(0.4~1.0 g/L)的L-半胱氨酸对链格孢菌芽管伸长均有不同程度的抑制作用。其中,1.0 g/L的L-半胱氨酸处理组芽管长度仅为16.31 μm,抑制率高达81.30%,显著高于其他各组(P<0.05)。由此可得,L-半胱氨酸质量浓度越高,对链格孢菌芽管伸长的抑制效果越好。


图1 L-半胱氨酸质量浓度对链格孢菌孢子萌发的抑制效果


图2 L-半胱氨酸质量浓度对链格孢菌芽管伸长的抑制效果
 

相关链接:L-半胱氨酸葡萄交链孢霉腐病二氧化硫臭氧氨基酸氯酸钠乙醇北纳生物

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