蜂花粉是蜜蜂从植物中采集花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液后制成的呈扁圆形的团状物，是蜜蜂蜂群主要的蛋白质来源。蜂花粉具有很高的营养价值，包含蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素、脂类以及酶、辅酶、激素、黄酮、多肽、微量元素等多种生物活性物质，被誉为“微型营养库”。蜂花粉中多酚类和黄酮类物质广泛存在，被认为是有效的抗氧化剂。蜂花粉具有抗动脉粥样硬化活性和抗菌活性，对心脏病、高血压、高血脂、高血糖等心脑血管疾病具有很好的预防和改善作用，可调节人体免疫能力和神经系统。因此蜂花粉作为天然营养保健品，其生物活性相关研究一直受到国内外研究学者关注，也是蜂花粉产品开发与应用的重要因素。

蜂花粉的营养物质丰富，但在加工生产过程中，存在粗放加工现象，可能造成蜂花粉产品受到微生物二次污染，进而导致蜂花粉产品质量的下降，甚至危害消费者健康。此外，作为蜜蜂的重要营养来源，蜂花粉中大量微生物的存在会危害蜜蜂的生长繁殖，可能影响蜂群的生产能力，降低蜂产品的质量，危害蜂农的利益。

蜂花粉产品的生产量及销售量日益增长，但关于蜂花粉产品产业链微生物污染状况的相关报道仍较少。本研究收集了浙江省主要蜂花粉产区的代表性蜂花粉产品，参考国家标准对蜂花粉产品中细菌和真菌菌落总数进行检测，并使用16S rDNA和ITS扩增子测序技术对茶花粉和荷花粉的细菌菌群结构及真菌菌群结构进行分析讨论。本研究旨在较为准确地评估蜂花粉产品的微生物污染状况，提升蜂花粉产品的质量安全水平。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

在浙江省龙游、长兴、兰溪、江山、武义、宁波等市县共采集107 个蜂花粉样品，养蜂场购买59 份，其中17 份为现场新鲜采集；市场购买50 瓶。蜂花粉类型包括油菜花粉（44 份）、茶花粉（31 份）、荷花粉（11 份）、杂花粉（7 份）、伍倍子花粉（4 份）、荞麦粉（3 份）、野玫瑰花粉（3 份）、益母草粉（3 份）、葵花粉（1 份）。

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、孟加拉红琼脂培养基 北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Gel Doc凝胶成像系统 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；MP FastPrep-24组织研磨仪 美国MP生物医疗公司；电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；5424R微量高速离心机 艾本德中国有限公司；Nanodrop ONE核酸定量仪 赛默飞世尔科技中国有限公司；SW-CJ-ICU超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离

称取5 g蜂花粉样品分别按GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》和GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行菌落总数、霉菌酵母总数的测定。

1.3.2 含水量检测

称取2～5 g蜂花粉样品，按照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中干燥法对水分含量进行检测。

1.3.3 16 S rDNA及ITS扩增子测序

DNA抽提使用试剂盒PowerSoil DNA Isolation Kit方法进行抽提，浓度使用Nanodrop进行定量，同时通过凝胶电泳检测。细菌的16S rDNA扩增子测序使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对16S rDNA的V3-V4区进行扩增测序。真菌的ITS扩增子测序选用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物进行扩增测序。扩增子测序委托上海美吉生物医药科技有限公司使用Illumina MiSeq平台，PE reads的质控、OTU聚类分析、α多样性和β多样性等分析使用I-Sanger云平台（https://www.i-sanger.com/）。

1.4 统计学分析

本实验涉及的统计分析和相关图形绘制使用GraphPad Prism软件。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉的含水量

图1 107 份蜂花粉的水分含量

如图1所示，107 份蜂花粉总体的含水量在8.06%～32.92%之间。17 份在蜂场当天收集的新鲜蜂花粉的含水量较高，在18.92%～32.92%之间，42 份经过1～2 d晾晒后的蜂花粉含水量分布为8.06%～15.87%。在市场上流通的蜂花粉含水量主要集中在9.42%～16.86%之间。

2.2 微生物污染分析

图2 蜂花粉的细菌菌落总数与真菌菌落总数

如图2所示，有8 个样品未培养出可见克隆，其中两个样品菌落总数在2.5×105 CFU/g以上，其他样品在5×101～2.7×104 CFU/g区间范围。霉菌总数只有2 个样品未培养出可见的克隆，其中两个样品的菌落总数在2.7×105 CFU/g以上，其他样品在5×101～6.5×104 CFU/g区间范围。从图2A可以看出，蜂花粉中的真菌菌落总数相比细菌菌落总数较大，并且差异有显著性。由于真菌可见培养的菌落绝大多数是霉菌，说明蜂花粉被污染霉菌的风险较细菌更高。

59 份在蜂场购买的蜂花粉（含水量高于18.92%的样品17 份与晾晒后的样品42 份）的菌落总数进行对比。结果显示，低含水量的蜂花粉无论是在细菌菌落总数（图2B）上还是真菌菌落总数（图2C）都高于高含水量的蜂花粉，差异具有显著性。高含水量（＞18%）的蜂花粉较新鲜，直接从蜂箱外采集，可以基本排除后期加工贮运的污染；低含水量（＜17%）的蜂花粉通过晾晒、贮运等环节，增加了霉菌污染的风险。

2.3 细菌菌群结构分析

对零售市场上购买的商品化的7 份荷花粉和5 份茶花粉样品进行16S rDNA扩增子测序，其中1 份测序获得reads数明显偏低，数值没有加入分析。根据稀释曲线可知11 个样本获得的reads数量饱和（图3A），并进行了细菌菌群结构分析。聚类分析后，共获得663 个无冗余的分类单元（operational taxonomic unit，OTU），可确定具有明确分类地位的属208 个。从图3可以看出，茶花粉与荷花粉细菌菌群多样性结构无显著性差异。从科水平统计，蓝细菌和肠杆菌占比例最大。在属水平上，主要的细菌污染源为蓝细菌、肠杆菌科类细菌及乳杆菌，其中乳杆菌也广泛存在于蜜蜂的肠道中。另外，可以发现茶花粉相比荷花粉，含有的莫拉氏菌科的细菌更丰富。该科的细菌有部分是条件致病菌，茶花粉中更丰富的原因可能是与茶花的生长环境相关，或者是采集茶花特殊的蜂群肠道中含有该类菌，在蜜蜂加工的过程中传播到蜂花粉中。

图3 荷花粉和茶花粉细菌菌群多样性分析

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