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枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑菌机制对比研究(一)

发布时间:2021-03-27 18:02 作者:陈丹
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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是食品中常见的食源性致病菌,广泛分布于自然界中,容易污染乳制品、水产品和肉制品等食品,造成食物中毒,进而威胁人类的生命健康安全[1]。因此,有效抑制食品中金黄色葡萄球菌的生长繁殖、提高食品安全性,是对人类健康和生命安全的重要保障。

抗菌肽是一类天然的具有抗细菌或真菌作用的小分子生物活性肽,因有望成为新型天然食品防腐剂而备受关注[2]。作为天然来源的抗菌肽,与传统的抗菌剂相比,其独特的抑制病原微生物生长且不易产生耐药性的机理已成为广大学者的研究热点。Powers等[3]研究发现抗菌肽polyphemusin可破坏大肠杆菌细胞膜,从而使菌体裂解死亡;陈飞龙等[4]研究发现抗菌肽F1能够以嵌插方式与金黄色葡萄球菌的DNA结合,干扰其正常代谢,从而达到抑菌效果。然而,由于抗菌肽生产成本高昂,且对其抑菌机理研究尚不够深入,限制了其在食品及农业生物防治等方面的应用发展[5]。

螺旋藻渣是螺旋藻粉生产过程中的沉积物,其蛋白质含量高、价格低廉。在本课题组前期研究中,采用枯草芽孢杆菌YA215发酵螺旋藻渣,发现其发酵产物具有显著的抗金黄色葡萄球菌效果[6],后续通过Sephadex LH-20凝胶层析柱和反相高效液相色谱法进行分离纯化,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱从发酵产物中鉴定得到两种抗菌多肽:一种是伊枯草菌素(iturin A),分子质量1 043.44 Da,为枯草芽孢杆菌自身代谢产物[7];另一种是螺旋藻渣发酵过程中产生的新型抗菌肽,将其命名为SP-AP-1,分子质量1 422.60 Da,氨基酸序列为ATHDNCCLRQS。两种抗菌肽iturin A和SP-AP-1对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)分别为0.052 mg/mL和0.014 mg/mL,本实验以金黄色葡萄球菌为指示菌,从细胞膜表面疏水性、细胞膜通透性、K+泄漏情况、蛋白质合成和基因组DNA迁移变化等方面探究两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌机理,并比较其抗菌效果,以期为抗菌肽iturin A和SP-AP-1在食品和药品领域中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

金黄色葡萄球菌CGMCC 14519由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。

抗菌肽SP-AP-1(纯度>95%)由湖北普罗金科技有限公司合成;iturin A购自美国Sigma公司。

正十六烷、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 上海麦克林生化科技有限公司;曲拉通 北京索莱宝科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;考马斯亮蓝R-250 天津市科密欧化学试剂有限公司;Nisaplin 丹尼斯克(中国)有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-6100紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;SW-CJ-2F洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;ZEEnit700P原子吸收光谱仪 德国耶拿分析仪器股份公司;MOS-450圆二色光谱仪 法国Bio-Logic公司;SCIENTZ-48L冷冻型高通量组织研磨器 宁波新芝生物科技股份有限公司;GI80TW高压蒸汽灭菌锅致微(厦门)仪器有限公司;ZQZY-85CS振荡培养箱上海知楚仪器有限公司;Gel-Doc XRS免疫电泳成像系统美国Bio-Rad科技公司;RF-5301PC荧光分光光度计岛津企业管理中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长的影响

参照孟兆丽[8]的方法并稍作修改,将Nisaplin、抗菌肽SP-AP-1和iturin A分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液(菌液浓度为108 CFU/mL)中,使其终质量浓度均为1 MIC。37 ℃、200 r/min连续培养24 h,每隔2 h进行取样,测定OD600 nm,绘制生长曲线,以未加入抗菌样品溶液的金黄色葡萄球菌作为空白对照。

1.3.2 抗菌肽对细菌细胞表面疏水性的影响

表面疏水性的测定参照Hou Lixia[9]和Pelletier[10]等的方法并稍作修改,采用0.02 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤对数期金黄色葡萄球菌并用0.1 mol/L KNO3溶液重悬(菌液浓度为108 CFU/mL),依次将质量浓度分别为1、1/2、1/4、1/8 MIC的两种抗菌肽溶液与菌悬液等体积混合,对照组为等量PBS。37 ℃、200 r/min培养30 min,测定OD405 nm(OD0);然后吸取体积为1.2 mL的菌悬液,向其中加入200 µL十六烷,25 ℃摇床混匀2 min,静置15 min,直至菌悬液和十六烷两相溶液完全分层,小心吸取水相,测定OD405 nm(OD1)。细菌细胞表面疏水性按下式计算。


1.3.3 抗菌肽对细菌细胞内膜渗透性的影响

参照Ibrahim等[11]的方法并稍作修改,吸取1 mL对数生长期金黄色葡萄球菌菌液,8 000 r/min离心15 min,收集菌体沉淀并用己灭菌的生理盐水清洗两次,然后将洗涤后的菌液加入到10 mL的M9乳糖诱导培养基中,37 ℃振荡培养8 h,离心,洗涤菌体沉淀并用β-半乳糖苷酶反应缓冲液将其重悬,使其OD630 nm在0.2左右。吸取重悬液1.6 mL,分别向其中加入200 µL 质量浓度为1 MIC的两种抗菌肽溶液,再加入200 µL质量浓度为1 mg/mL的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷,混合均匀,37 ℃水浴5 h,间隔1 h测定OD405 nm的变化情况,阴性对照为PBS,阳性对照为曲拉通。

M9乳糖诱导培养基(以1 L灭菌水计):乳糖5 g、Na2HPO4·7H2O 12.8 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1 g、KH2PO4 3 g、CaCl2 0.01 g、MgSO4 0.5 g,121 ℃、0.1 MPa湿热灭菌15~20 min。

β-半乳糖苷酶反应缓冲液(以1 L灭菌水计):Na2HPO4·12H2O 2.9 g、NaCl 8 g、KH2PO4 0.24 g、KCl 0.2 g、MgSO4 0.25 g、β-硫基乙醇0.39 g。

1.3.4 抗菌肽对细菌细胞内K+泄漏的影响

将金黄色葡萄球菌菌悬液( 菌液浓度为108 CFU/mL)分别与质量浓度1 MIC的两种抗菌肽混合,37 ℃孵育一定时间,10 000 r/min离心10 min,对照组为金黄色葡萄球菌菌悬液(菌液浓度为108 CFU/mL,不添加任何抗菌肽溶液),采用原子吸收光谱仪测定上述上清液中K+质量浓度的变化情况,每隔10 min记录一次,共记录7 次。

1.3.5 抗菌肽对细菌胞内蛋白质合成的影响

1.3.5.1 菌体胞内蛋白质相对含量的测定

参照郭娟等[12]的方法,将培养至对数生长期的金黄色葡萄菌10 000 r/min离心15 min,收集菌体并重悬为108 CFU/mL菌悬液,在100 mL菌悬液中分别加入质量浓度0.5 mg/mL的SP-AP-1和iturin A(终质量浓度均为1 MIC)和质量浓度0.5 mg/mL Nisaplin,对照组加入等体积无菌蒸馏水,37 ℃恒温培养,分别取间隔培养1 h的菌悬液10 mL,离心,收集菌体沉淀并用PBS洗涤两次。将沉淀转移至研钵,液氮研磨,加入500 µL 20 g/100 mL三氯乙酸和400 µL超纯水,冰浴10 min后离心取沉淀。用10 g/100 mL三氯乙酸再次重悬取沉淀,将菌体转移至无菌试管中,加入100 µL生理盐水重悬,再加入5 mL考马斯亮蓝染色液,室温放置30 min后在595 nm波长处测定OD595 nm。

1.3.5.2 菌体蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌用LB液体培养基培养液重悬后,分别加入两种抗菌肽溶液(质量浓度设置:1 MIC和5 MIC),为确保实验准确性,本实验采取两次对照(加入等体积的无菌蒸馏水),37 ℃、200 r/min培养8 h,8 000 r/min离心20 min,收集菌体,向菌体沉淀中加入500 µL PBS和0.3 g石英砂,8 000 r/min离心4 min,收集上清液,取20 µL上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析。

1.3.6 抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响

参考宁亚维等[13]的方法并稍作修改。采用DNA提取试剂盒对金黄色葡萄球菌基因组DNA进行提取,利用凝胶阻滞法观察SP-AP-1和iturin A对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响。将金黄色葡萄球菌基因组DNA与质量浓度分别为1、2、3 MIC和4 MIC的两种抗菌肽溶液按照体积比1∶1混合,对照组为金黄色葡萄球菌基因组DNA(不添加抗菌肽溶液),总反应体积为4 µL。充分混匀后,37 ℃恒温水浴60 min。反应结束后,用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳观察并分析基因组DNA的迁移结果。

1.3.7 抗菌肽作用于细菌细胞膜时二级结构的变化

分别采用30 mmol/L SDS溶液和10 mmol/L PBS将两种抗菌肽配制成质量浓度为0.5 mg/mL的溶液,在石英比色皿中加入一定体积的抗菌肽溶液,25 ℃下用圆二色光谱仪对样品进行180~260 nm的远紫外扫描并采集数据,扫描速率50 nm/min,带宽1.0 nm。对扫描后的所有图谱用CDNN软件进行减噪处理并对样品溶液的二级结构相对含量进行拟合计算。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次,实验数据采用SPSS Statistics 19软件与Origin 9.1软件进行统计分析,以平均值±标准差表示。采用Duncan法进行显著差异性比较,P<0.05表示差异显著。

相关链接:金黄色葡萄球菌抗菌肽致病菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌伊枯草菌素细胞膜正十六烷菌液乳糖十二烷基硫酸钠蛋白北纳生物

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