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枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑菌机制对比研究(二)

发布时间:2021-03-27 18:11 作者:陈丹
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2 结果与分析

2.1 抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长的影响

由图1可知,添加抗菌肽SP-AP-1和iturin A的金黄色葡萄球菌菌液在培养4 h后其生长曲线均发生明显变化,菌液质量浓度逐渐降低,8 h后OD600 nm逐渐趋于稳定,而对照组菌落生长正常,无明显变化,表明两种抗菌肽均能够在金黄色葡萄球菌的对数生长期内抑制其生长繁殖,且SP-AP-1比iturin A有更强的抑制作用。


图1 抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长的影响

2.2 抗菌肽对细菌细胞表面疏水性的影响

正十六烷是一种有机相,金黄色葡萄球菌在水相和有机相中的吸附率是不同的,因此,细菌细胞表面疏水性的改变可由吸附率来反映[14]。如图2所示,当抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黄色葡萄球菌后,各组间和组内的细胞吸附率均存在显著性差异(P<0.05)。其中,经iturin A处理后,金黄色葡萄球菌细胞吸附率从PBS组的77.3%降为37.6%,而经SP-AP-1处理的菌液细胞吸附率仅为33.5%,两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞吸附率的影响均呈浓度依赖性。有研究表明,细胞表面疏水位点主要为蛋白质-脂类和糖-脂类等物质[15],故推测细胞表面疏水性降低的可能原因为抗菌肽与金黄色葡萄球菌细胞表面相互作用,吸引电负性基团造成重排,从而导致金黄色葡萄球菌细胞表面电负性增强,疏水性下降[16]。

图2 抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞表面疏水性的影响

大、小写字母不同分别表示不同质量浓度iturin A、SP-AP-1之间差异显著(P<0.05)。

2.3 抗菌肽对细菌细胞内膜渗透性的影响

细菌经乳糖诱导后,其细胞内膜上能产生一种将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的β-半乳糖苷酶[17]。邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷可作为乳糖替代物被β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚,故通过测定反应体系中OD值来反映抗菌肽对细菌细胞内膜的破坏程度[18]。

图3 抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞内膜通透性的影响

*.SP-AP-1和iturin A两种抗菌肽之间存在显著性差异(P<0.05),图4、5同。

由图3可知,当抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌后,两种抗菌肽的OD405 nm均随时间的延长而增大,且在3 h时OD405 nm达到最高,反应体系进行到5 h时,SP-AP-1组OD405 nm显著高于iturin A组(P<0.05)。而在整个反应过程中,PBS阴性对照组基本无明显变化,其OD405 nm稳定在0.42左右,这表明添加SP-AP-1和iturin A对金黄色葡萄球菌细胞内膜造成了一定的损伤作用,导致其细胞内膜渗透性增大、通透性增强,底物邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷进入细胞内的数量增多,β-半乳糖苷酶催化分解速率加快,故黄色产物邻-硝基苯酚增多,OD405 nm增大。随着时间的延长,由于β-半乳糖苷酶数量有限,催化分解的速率达到最大值时,OD405 nm不再随底物邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷的增加而增大,而是保持相对稳定的趋势。这与赵广旭[19]和张宇[20]自主设计的抗菌多肽具有类似作用效果,说明抗菌肽通过引起细菌细胞内膜通透性改变,达到抑制或杀死细胞的效果。

2.4 抗菌肽对细菌细胞膜内K+的泄漏影响


图4 抗菌肽诱导金黄色葡萄球菌细胞内K+释放量的变化

细胞内K+的泄漏是离子泄漏的典型代表之一,其泄漏程度可反映抗菌肽作用于细胞时细胞膜的损伤程度[21-22]。由图4可知,金黄色葡萄球菌经SP-AP-1和iturin A处理后,其胞内K+释放量随时间的延长均呈快速增长趋势,而对照组变化不明显,表明SP-AP-1和iturin A均能使金黄色葡萄球菌细胞膜通透性发生改变,且比较两种抗菌肽的作用效果发现,SP-AP-1比iturin A对金黄色葡萄球菌细胞膜的透化作用更强(P<0.05),这与2.3节中抗菌肽对细菌细胞内膜的渗透性影响结果相符,充分说明SP-AP-1和iturin A均能与金黄色葡萄球菌细胞膜相互作用,破坏其细胞膜的完整性,导致菌体死亡。然而SP-AP-1和iturin A引起金黄色葡萄球菌细胞膜完整性的破坏是否是导致其细胞死亡的主要原因还需进一步研究。

2.5 抗菌肽对细菌胞内蛋白质合成的影响

2.5.1 菌体胞内蛋白相对含量分析结果


图5 抗菌肽对金黄色葡萄球菌胞内蛋白相对含量的影响

由图5可知,对照组胞内蛋白相对含量随时间的延长而持续增加,且在10 h后保持稳定,而添加抗菌肽的实验组金黄色葡萄球菌胞内蛋白相对含量均呈先增加后降低的趋势。郭娟等[12]研究发现,抗菌肽与细菌作用后,短时间内细胞膜受损但尚未破裂,故其胞内蛋白相对含量表现出升高趋势。添加SP-AP-1和iturin A的实验组金黄色葡萄球菌胞内蛋白相对含量分别在4 h和6 h后急剧下降,且两组具有显著性差异(P<0.05),这可能是因为金黄色葡萄球菌细胞膜的破裂导致胞内蛋白相对含量降低,也可能是由于抗菌肽进入细胞后使其DNA转录和翻译过程受到抑制,因而菌体本身胞内蛋白含量降低[4]。

2.5.2 菌体蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果


图6 菌体蛋白SDS-PAGE分析结果

Marker.标准分子质量蛋白;为确保实验准确性,对照组测定两次。

由图6可知,对照组胞内蛋白条带完整清晰,而经抗菌肽SP-AP-1和iturin A处理后的实验组金黄色葡萄球菌胞内蛋白出现不同程度的缺失现象。其中,蛋白条带缺失较多的部分主要集中在分子质量17、20、25~35 kDa,说明两种抗菌肽可影响金黄色葡萄球菌的基因转录或翻译功能,进而抑制其蛋白质的合成,导致金黄色葡萄球菌胞内分子质量17、20、25~35 kDa之间的蛋白含量降低;同时,研究发现当两种抗菌肽质量浓度从1 MIC增大到5 MIC时,分子质量在48~75 kDa之间的蛋白也会发生明显的缺失现象,金黄色葡萄球菌的蛋白条带清晰度明显下降,颜色明显变浅,特别是经质量浓度5 MIC抗菌肽SP-AP-1处理后,金黄色葡萄球菌胞内蛋白条带几乎没有,说明增大抗菌肽SP-AP-1质量浓度,金黄色葡萄球菌胞内蛋白含量急剧降低,金黄色葡萄球菌胞内蛋白质的合成完全受到抑制。因此,SDS-PAGE实验进一步表明抗菌肽进入金黄色葡萄球菌细胞后,抑制其胞内蛋白合成,从而导致菌体死亡,且高质量浓度的抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有更强的抑制效果。陈飞龙等[4]研究了抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制,也发现抗菌肽F1能够造成分子质量20~30 kDa的蛋白含量降低,蛋白条带颜色显著变浅。

2.6 抗菌肽对菌体基因组DNA的影响


图7 抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响

如图7所示,不同质量浓度的抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黄色葡萄球菌后,菌体DNA条带并未发生明显的迁移现象,且部分DNA滞留于上样孔内,这可能是因为电荷电负性发生改变或DNA双螺旋结构改变,从而影响DNA迁移率[23-24]。增大两种抗菌肽质量浓度,iturin A作用的金黄色葡萄球菌菌体DNA条带迁移率和亮度没有明显变化,而SP-AP-1作用的金黄色葡萄球菌菌体DNA条带亮度逐渐变暗、颜色变浅,这是由于抗菌肽与溴化乙锭竞争性结合DNA[25],使金黄色葡萄球菌的基因功能受到影响,从而抑制其生长繁殖。Li Lirong等[26]研究发现细胞穿透肽衍生物可与溴化乙锭竞争性结合伤寒沙门氏菌DNA,从而导致菌体死亡;郭娟[12]和陈璇[27]等的研究也均证实了此观点。因此,虽然两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA没有明显阻滞作用,但推测抗菌肽SP-AP-1可能与溴化乙锭竞争性结合DNA,使核酸合成受到抑制,而抗菌肽iturin A不能达到此效果。

2.7 抗菌肽作用于细菌细胞膜时二级结构的变化分析结果

抗菌肽的抑菌活性与其二级结构的变化密切相关[28]。圆二色光谱法是目前测定蛋白质二级结构、研究蛋白质在稀溶液中的结构和构象变化的较为准确和应用广泛的方法之一[29]。本实验利用圆二色光谱法对两种抗菌肽在PBS和SDS疏水环境下的二级结构变化进行研究分析(图8)。


图8 两种抗菌肽在PBS和SDS缓冲液中的圆二色光谱

表1 两种抗菌肽二级结构的相对含量

两种抗菌肽在不同环境下的二级结构相对含量见表1。当抗菌肽SP-AP-1处于PBS体系中时,其二级结构主要以无规卷曲(相对含量43.3%)为主;当抗菌肽SP-AP-1处于SDS缓冲液体系中时,其二级结构中无规卷曲相对含量减少,α-螺旋、反向平行、平行及β-转角相对含量均有所增加,β-折叠(反向平行和平行)相对含量增加幅度最为明显;而抗菌肽iturin A二级结构相对含量变化主要以β-转角为主,当抗菌肽iturin A从PBS体系转变到SDS缓冲液体系后,其二级结构中β-转角相对含量从6.7%增加到27.5%。有研究表明,大部分抗菌肽通常在液体环境中的二级结构都是以无规卷曲为主,当抗菌肽接触细菌细胞膜后,其结构或构象会发生一定程度的变化,这种构象变化与其抗菌活性紧密相关[30]。因此,本实验中两种抗菌肽在缓冲液环境及模拟膜的疏水环境下二级结构的变化间接反映了当抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌时的抑菌机制。

3 结 论

本实验以螺旋藻渣抗菌肽SP-AP-1和iturin A为研究对象,对比了两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌机制。结果表明,iturin A主要通过引起金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加、抑制菌体蛋白合成,从而抑制菌体生长繁殖;而SP-AP-1对金黄色葡萄球菌的抑菌机制则是影响细胞膜通透性、抑制蛋白合成和竞争性结合DNA共同作用的结果,且其抑制效果比iturin A更为明显,为进一步探究抗菌肽SP-AP-1的广谱抗菌机制提供了一定的理论指导。

相关链接:抗菌肽金黄色葡萄球菌菌液细胞正十六烷β-半乳糖苷酶葡萄糖邻-硝基苯酚离子伤寒沙门氏菌DNA溴化乙锭北纳生物

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